Kaple, jako středisko reformního hnutí a českých kázání, byla postavena v I. 1391-1394. Na jejím založeni a vybudování se zvláště podílel královský dvořan Hanuš z Mühlheimu a staroměstský konšel Kříž. Pro staveniště kaple byla kromě zahrady zabrána i část veřejného pozemku se studnou (zachována v kapli) a část hřbitova staršího farního kostela sv. Filipa a Jakuba. V I. 1402-1413 byla Betlémská kaple působištěm M. Jana Husa (1371-1415). Na Husova kázání, pronikavě kritizující společenské poměry, se scházelo množství posluchačů z různých společenských vrstev a kaple se tak stala nejdůležitějším ohniskem reformního hnutí. V I. 1414-1429 zde kázal Husův přítel M. Jakoubek ze Stříbra. V I. 1609-1620 patřila kaple jednotě bratrské a působil zde senior Jan Cyrillus, pozdější tchán J. A. Komenského. V 17. a 18. stol. byla majetkem řádu jezuitů. Po zrušení řádu byla uzavřena a r. 1786 pobořena. Do zbývajících zdí byl v I. 1836-1837 vestavěn rozlehlý obytný dům. Po r. 1949, po zboření domu, zjistil archeologický výzkum, že z kaple zůstaly zachovány tří obvodní zdi. Kaple byla do r. 1954 kompletně obnovena a otevřena pro veřejnost.